摘 要
建立一種高效液相色譜柱后衍生法測定飼料中9種氨基甲酸酯類農藥（涕滅威砜、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威、仲丁威）殘留量的方法。樣品采用乙腈提取，氨基固相萃取柱分離凈化，濃縮，乙腈定容后，進行反相色譜梯度洗脫分離、柱后衍生化、熒光檢測器測定。結果表明，9種氨基甲酸酯類農藥在22
min內能實現基線分離，方法的回收率為80.0%~110.0%，檢出限為0.01 mg/kg，定量限為 0.05 mg/kg。
關鍵詞
氨基甲酸酯類農藥；飼料；高效液相色譜；柱后衍生
中圖分類號
S816.17
氨基甲酸酯類農藥大量使用于玉米、大豆等主要飼料原料的農作物生產中,由于氨基甲酸酯類農藥毒性較大，通過食物鏈傳遞,處于食物鏈終端的人類是**終的受害者,公眾健康安全受到威脅[1]。目前,該問題越來越被重視,我國有關部門已于2003年制定了《飼料中氨基甲酸酯類農藥殘留量測定氣相色譜法》[2]。但是，由于氨基甲酸酯類農藥的極性和熱不穩定性，該方法測定靈敏度和重現性均不是十分理想[3-4]，因此，開展氨基甲酸酯類農藥殘留量檢測技術的研究具有重要意義[5]。本文在查閱相關文獻的基礎上[6-9]，研究了高效液相色譜法測定飼料中氨基甲酸酯類農藥殘留量的可行性，對飼料中氨基甲酸酯類農藥殘留的測定方法進行了研究，建立了一種高效、準確的液相色譜測定方法。本方法靈敏度高，穩定性好，適用于飼料中氨基甲酸酯類農藥殘留量的測定。
1
試驗部分
1.1 儀器
Waters 2695高效液相色譜儀，配Waters
2475熒光檢測器和柱后衍生裝置；3k30型冷凍離心機（Sigma公司）；B-490旋轉蒸發儀(BüCHI公司);MS2
minishaker旋渦混勻器(IKA公司)；AG-285電子天平（Mettler公司）；20通道固相萃取裝置（Waters公司）。
1.2
試劑與材料
涕滅威砜、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威、仲丁威標準品均為德國D.E.公司產品，純度≥96.0％；甲醇、二氯甲烷均為分析純；乙腈為色譜純；無水硫酸鈉為分析純；柱后衍生試劑：0.05
mol/l NaOH溶液和OPA衍生試劑均購自美國Pickering公司；氨基固相萃取柱購自杭州富裕科技有限公司（500 mg/6 ml）。
1.3
色譜條件
1.3.1 液相色譜柱條件
Waters Symmetry C18柱，250 mm×4.6 mm，粒徑5.0 μm；進樣量：20
μl；流動相采用梯度洗脫，條件見表1，柱溫：35 ℃。
1.3.2 柱后衍生條件
水解溫度:85 ℃;堿液:0.05 mol/l
NaOH溶液,流速:0.3 ml/min;OPA試劑流速：0.3 ml/min；衍生溫度:室溫。
熒光檢測器:激發波長330 nm;發射波長465
nm。
1.4 標準溶液配制
1.4.1 OPA衍生試劑配制
準確稱取100 mg鄰苯二甲醛,用20 ml甲醇溶解,加入OPA稀釋液940
ml,備用。另取巰基乙醇2.0 g用10 ml OPA稀釋液溶解，轉移至上述溶液中，混勻，超聲脫氣，備用。
1.4.2
農藥標準溶液配制
1.4.2.1 單個農藥標準溶液
準確稱取適量農藥標準品（精確至0.1 mg），用乙腈溶解，配制成1 000
mg/l的單一農藥標準儲備液，貯存于-18 ℃以下冰箱中。使用時根據需要吸取適量標準儲備液用乙腈稀釋成標準工作液。
1.4.2.2
農藥混合標準溶液
準確吸取一定體積的單個農藥儲備液于同一容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,配制成農藥混合標準儲備液,使用前用乙腈稀釋成所需濃度的標準工作液。
1.5
樣品處理
1.5.1 試樣制備
實驗室樣品經混合均勻后,按四分法縮減至100 g,粉碎,使之完全通過0.45
mm篩孔，再充分混合，備用。
1.5.2 提取
準確稱取試樣（5±0.1） g置50 ml離心管中，加20 ml乙腈，渦旋1 min，6 000
r/min離心5 min，分出上清液，過無水硫酸鈉，收集于茄心瓶中，剩余物用20 ml乙腈重復提取一次，過無水硫酸鈉，收集于同一茄心瓶中，50
℃下旋轉蒸發至干，備用。
1.5.3 凈化
用4 ml甲醇-二氯甲烷(體積比為1：99)溶解茄心瓶內物質,轉移至固相萃取柱(使用前用4
ml甲醇-二氯甲烷平衡)中,收集流出液。再用4 ml甲醇-二氯甲烷(體積比為1：99)洗茄心瓶,重復一次,收集洗脫液,在50
℃減壓旋轉蒸發濃縮至干,用乙腈定容至2.0 ml,過0.45 μm濾膜，上機測定。
1.5.4 色譜分析
分別吸取20
μl標準混合溶液和凈化后的樣品溶液注入液相色譜儀中，以保留時間定性，以峰面積定量。
2 結果與討論
2.1
流動相的選擇
試驗中我們考察了甲醇-水、乙腈-水體系作為流動相對氨基甲酸酯類農藥的分離效果。結果發現，甲醇-水、乙腈-水可以對氨基甲酸酯類農藥實現分離，當乙腈-水體系作為流動相時，待測物氨基甲酸酯類農藥的響應信號較強，分離效果更好，而甲醇-水體系流動相的極性雜質較多，個別峰峰形不理想，干擾較大，響應信號較低，故我們選擇乙腈-水體系作為流動相，具體配比見表1。不同流動相體系圖譜比較見圖1，上機液濃度為200
ng/ml。
2.2
提取溶劑的選擇
由于氨基甲酸酯類農藥難溶于水,較易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑。我們分別選擇甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯作為提取溶劑,在同一添加水平,相同實驗條件下,對樣品進行回收率試驗。試驗結果表明,使用乙酸乙酯、丙酮的回收率明顯低于甲醇、乙腈作為提取劑的回收率,而甲醇使樣品基質干擾較大,圖譜基線漂移較大,因此,本方法采用乙腈作為提取劑。
2.3
固相萃取柱條件的選擇
根據查閱的資料，我們選擇了氨基固相萃取柱作為凈化柱，凈化樣品，洗脫劑選擇甲醇-二氯甲烷（1：99）,對洗脫劑的用量進行了考察,結果表明,回收率隨洗脫劑體積增加而增加，當體積達到8
ml(4 ml+4 ml)后，繼續增加洗脫液對回收率的影響不大。
采用以上確定的前處理方法，進行方法學考察，對配合飼料添加濃度為40
ng/g的樣品進行檢測，所得空白樣品和添加樣品色譜圖見圖2。
2.4 線性方程和檢出限
配制氨基甲酸酯類農藥濃度20.0~500
μg/l的系列混合標準溶液，按1.3節建立的儀器條件進行測定。分別以峰面積Y對含量X（μg/l）作標準曲線，9種農藥的相關系數r均大于0.999
5，在20.0~500 μg/l范圍內具有良好的線性關系。以3倍信噪比為檢出限(LOD)，9種待測農藥的檢出限達到0.01
mg/kg，定量限（LOQ）為0.05 mg/kg。
2.5
回收率試驗
取同一批號的空白配合飼料樣品，加適量混合標準工作液，使加標量為0.05、0.10、0.50
mg/kg，按1.5節的方法處理后進行儀器分析。每個濃度點取5份樣品，求其平均回收率，并計算批內相對標準偏差，結果詳見表2。
由表2的數據可知，飼料中9種氨基甲酸酯類農藥的加標量為0.05、0.10、0.50
mg/kg時，批內相對標準偏差在11.5%以內，平均回收率在80％以上。在此基礎上，把建立的方法應用于濃縮料、預混合飼料、單一飼料等樣品的測定，均取得了滿意結果。
3
結論
本文建立了以乙腈為提取劑、經氨基固相萃取柱凈化、高效液相梯度洗脫分離、熒光檢測器檢測，定性、定量測定飼料中9種氨基甲酸酯類農藥殘留量的方法。該方法測定農藥種類較多，操作過程簡單，測定結果準確，是測定飼料中氨基甲酸酯類農藥行之有效的方法。
